【文獻推薦】放射免疫沉淀法檢測N型電壓門控鈣通道抗體（N-VGCC）的性能評價

     N-VGCC RIA的性能與之前在MCL基于分級陽性預(yù)測值(PPV)檢測的139份血清的結(jié)果進行了比較。   

   陰陽一致性：用如上所述建立的參考區(qū)間(<70.0 pmol/L=陰性，70.0-110.0 pmol/L=疑似，>110.0 pmol/L=陽性)將ARUP獲得的N-VGCC抗體結(jié)果與梅奧臨床實驗室(MCL)的結(jié)果進行比較，總體上一致性較好(圖1)。然而，在低滴度陽性樣本中觀察到部分差異。弱陽性的N-VGCC抗體結(jié)果的PPV表明，即使對于參比實驗也很難確定臨界值，因此使用陽性預(yù)測值來評估一致性。兩種檢測 N-VGCC抗體陽性結(jié)果的一致性反映了參比實驗的每個范圍的分級PPV。

圖 1 將ARUP的N-VGCC抗體檢測結(jié)果與MCL檢測結(jié)果進行比較。這些檢測結(jié)果使用的是在開發(fā)階段建立的參考區(qū)間[（<70.0 pmol/L=陰性(虛線)，70.0-110.0 pmol/L=疑似，>110.0 pmol/L=陽性(實線)]和參比實驗結(jié)果進行比較。MCL結(jié)果分類按PPV分層。

   特異性：用P/Q-VGCC(n=20)、VGKC復(fù)合物(包括LGI1和CASPR2)、結(jié)合型AChR、神經(jīng)節(jié)AChR、NMDA、GAD65、NMDA、AQP4和ANA抗體陽性標本評估特異性?？傮w而言，在其他神經(jīng)自身抗體或ANA抗體陽性的標本中，N-VGCC抗體RIA的特異性為87%(圖2)。由于N-和P/Q-VGCC抗體先前已被證明在LEMS患者中共存，所以排除P/Q-VGCC抗體陽性標本，特異性提高到91%。疾病對照組中，有2例樣本的N-VGCC抗體濃度歸入疑似，其中1例AMPA抗體陽性，1例NMDA抗體陽性。對健康個體采集的血清樣本進行特異性評估，觀察到的特異性為97%，當排除三個疑似的結(jié)果時特異性為100%。

圖 2 用其他神經(jīng)自身抗體或抗核抗體陽性的樣本和健康對照評估特異性。P/Q-VGCC陽性病例中抗-N-VGCC陽性對照比例最高，與文獻報道一致。其他樣本包括3例NMDA、3例GAD65、2例AMPA和2例AQP4抗體陽性樣本。

   精密度、干擾和分析物穩(wěn)定性評估：用2個陰性(5.4 pmol/L，38.7 pmol/L)，2個弱陽性(130.1 pmol/L，137.8 pmol/L)和2個強陽性(402.6 pmol/L，857.6 pmol/L)進行精密度、干擾和分析物穩(wěn)定性評估。精密度的評估是通過三次測定，一次測定檢測樣品3次（批內(nèi)精密度），另外兩次測定檢測樣品一次。三次檢測的第一個結(jié)果被用于評估測定間精密度。N-VGCC的實驗內(nèi)和實驗間變異系數(shù)均可接受。陽性標本的批內(nèi)精密度和批間精密度的變異系數(shù)分別小于5%和<20%。由于陰性標本結(jié)果數(shù)值較低，觀察到CV值升高。然而，由于定性結(jié)果沒有改變，結(jié)果被認為是可以接受的。自ARUP實驗室實施該測定以來，在每次臨床運行中都測試了4個水平對照樣品(平均值：15.7 pmol/L、155.5 pmol/L、197.1 pmol/L、531.5 pmol/L)。這些對照已經(jīng)在9批試劑上進行了90多次檢測，陽性對照的批間CV<20%，陰性對照的CV升高，但定性一致。血紅蛋白濃度達1520 mg/dL、甘油三酯濃度達4474 mg/dL、游離膽紅素濃度達13.75 mg/dL對結(jié)果無顯著影響(陽性標本CV<15%，陰性標本定性一致)。室溫保存48 h，冷藏(2~8 ℃)2周或冷凍(?20 ℃)30 天，3次以內(nèi)的反復(fù)凍融對結(jié)果無顯著影響(陽性標本CV<25%，陰性標本定性一致)。

   對132例送檢于本實驗室（ARUP）的P/Q-VGCC抗體檢測標本(44例陽性，37例疑似，51例陰性)進行了N-VGCC抗體與P/Q-VGCC抗體共存的檢測。總體而言，13%(17/132)N-VGCC和P/Q-VGCC抗體均陽性，11%(14/132)N-VGCC抗體陽性和P/Q-VGCC抗體陰性，18%(124/132)N-VGCC抗體陰性和P/Q-VGCC抗體陽性，27%(35/132)兩者均為陰性(圖3)。

圖 3 在ARUP先前檢測過P/Q-VGCC的標本中對N-VGCC結(jié)果進行評估。A)用本研究建立的參考區(qū)間[<70.0 pmol/L=陰性(虛線)，70.0-110.0 pmol/L=疑似，>110.0 pmol/L=陽性(實線)]和P/Q-VGCC臨床檢測報告中提供的結(jié)果，將N-VGCC的結(jié)果與P/Q-VGCC的結(jié)果進行比較。通過定性解釋對P/Q-VGCC結(jié)果分類進行分層。B)用ARUP檢測報告中提供的P/Q-VGCC參考區(qū)間[<24.6 pmol/L=陰性(虛線)，24.6-45.6 pmol/L=疑似，>45.6 pmol/L=陽性(實線)]，對按定性解釋分層的N-VGCC結(jié)果類別進行反向評價。

   46例N-VGCC抗體陽性標本中，37%(17/46)P/Q-VGCC抗體共存，33%(15/46)P/Q-VGCC結(jié)果疑似，30%(14/46)無P/Q-VGCC抗體共存。在44例P/Q-VGCC抗體陽性的標本中，39%(17/44)存在N-VGCC抗體，7%(3/44)具有疑似的N-VGCC結(jié)果，54%(24/44)不存在N-VGCC抗體。在N-VGCC抗體檢測結(jié)果疑似的9例標本中，33%(3/9)為陽性，44%(4/9)為疑似，23%(2/9)為P/Q-VGCC抗體陰性。在P/Q-VGCC抗體檢測結(jié)果疑似的37例標本中，N-VGCC抗體的檢測結(jié)果為40%(15/37)為陽性，11%(4/37)為疑似，49%(18/37)為陰性。這些結(jié)果與以往報道的疑似副腫瘤性自身免疫性神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者中N-和P/Q-VGCC抗體共存但不完全重疊的報道一致，證實了N-VGCC抗體RIA檢測N-VGCC抗體的特異性。

在用于評估APUP和MCL兩家機構(gòu)之間N-VGCC抗體結(jié)果一致性的156份樣本中，45份(29%)的結(jié)果不一致。在19例具備臨床資料的N-VGCC抗體陽性患者中，5例在兩個實驗室內(nèi)均陽性，1例MCL結(jié)果陽性，ARUP結(jié)果疑似，9例MCL結(jié)果陽性，ARUP結(jié)果陰性，4例ARUP結(jié)果陽性，MCL結(jié)果陰性。兩個實驗室之間的差異主要涉及弱陽性結(jié)果。檢測結(jié)果不一致的患者有自身免疫性疾病或癌癥的跡象，但沒有LEMS、自身免疫性腦炎或自主神經(jīng)障礙的跡象。

（表一-截取上部分）

（表一-截取下部分）

表 1 兩個實驗室之間的差異涉及N-VGCC抗體弱陽性，這與其他免疫狀況有關(guān)，主要是自身免疫，而不是LEMS或相關(guān)疾病。

對這19例具備臨床資料的N-VGCC抗體陽性患者進行了P/Q-VGCC抗體水平評估，其中2例患者P/Q-VGCC抗體在兩個實驗室均為陽性，10例兩個實驗室P/Q-VGCC抗體均為陰性。1例MCL陽性但ARUP疑似(病例5)，該患者患有2型糖尿?。?例ARUP陽性但MCL陰性，其中1例患有結(jié)腸癌（病例3），另1例患有自主神經(jīng)病變和干燥綜合征；4例MCL陽性但ARUP陰性，分別為伴有小腦萎縮的LEMS（病例1），體位性心動過速綜合征（POTS，病例6），其他胰腺癌(病例16，在獲取臨床信息時死亡)，以及遺傳性和特發(fā)性神經(jīng)?。ú±?7）。

   關(guān)于N-VGCC抗體檢測，MCL和ARUP兩家實驗室結(jié)果對比總結(jié)：基于分級PPV的實驗室間定性符合率為>1.00 nmol/L (71%PPV)為100%，0.10-0.99 nmol/L   (24%PPV)為48%，0.04-0.10 nmol/L (19%PPV)為22%。陰性結(jié)果顯示90%符合(n=106)。其他神經(jīng)自身抗體陽性的對照組和健康對照組的特異性分別為87%和100%。在其他性能特征方面也觀察到了可接受的結(jié)果。

   N-VGCC抗體的存在與包括LEMS在內(nèi)的多種炎癥性神經(jīng)自身免疫性疾病有關(guān)。雖然N-VGCC抗體的檢出很罕見，但在副腫瘤抗體組中，這些抗體在15種抗體中排名第五或第六，據(jù)報道，除了它們的診斷意義外，還具有一些預(yù)后價值。鑒于可開展N-VGCC抗體檢測的機構(gòu)有限，RSR Limited開發(fā)的N-VGCC抗體RIA法可填補臨床需求。RSR N-VGCC RIA的性能評估顯示，與行業(yè)疾病預(yù)測最佳的MCL RIA參比分析對比有很好的一致性。此外，在本次評估中，對可接受的分析性能(包括重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和干擾)的所有其他預(yù)定義期望均達到要求。

MCL實驗室探究了N-VGCC抗體的相對濃度與它們對臨床疾病譜的陽性預(yù)測值之間的關(guān)系。在這項研究中，有19例ARUP和/或MCL的N-VGCC抗體陽性患者的臨床資料可用(表1)。1例（病例1）MCL(PPV) N-VGCC抗體檢測結(jié)果>1.00 nmol/L(71%PPV)，該患者伴有小腦萎縮的LEMS征象（ARUP檢測結(jié)果為364.1pmol/L，強陽性）。9例在MCL的N-VGCC抗體結(jié)果為0.10-0.99 nmol/L(24%PPV)，其中2例(22%)表現(xiàn)出與LEMS或自身免疫性腦炎一致的癥狀。這兩例患者在ARUP檢測時也呈陽性，并顯示出在這類有臨床診斷的患者中觀察到的最高的N-VGCC抗體水平。5例MCL N-VGCC抗體檢測結(jié)果為0.03~0.09 nmol/L(19%PPV)，其中1例(20%)出現(xiàn)LEMS癥狀。這例患者在ARUP檢測時也呈陽性，并顯示出在這一患者亞組中觀察到的最高的N-VGCC抗體水平。這五例患者中有兩例有自主神經(jīng)病變，有四例有其他免疫狀況，但沒有一例患者的癥狀與LEMS或自身免疫性腦炎的診斷相符。在19例有臨床病史的患者中，其余4例患者在MCL的N-VGCC抗體結(jié)果為陰性，而在ARUP呈弱陽性（病例7，16，17，19，其中病例7和 16在獲取臨床信息時死亡）。這4例患者都有其他免疫狀況，但沒有與LEMS或自身免疫性腦炎相一致的癥狀。

與其他文獻所述一致，N-VGCC抗體與P/Q-VGCC抗體共存頻率最高。使用LEMS患者血清的早期研究表明，幾乎所有N-VGCC抗體陽性的樣本也都有P/Q-VGCC抗體陽性，并提示這可能是由于在N-VGCC和P/Q-VGCC中發(fā)現(xiàn)了一個共同的表位。更多近期研究使用副腫瘤抗體評估的血清顯示，N-VGCC和P/Q-VGCC抗體之間的重疊顯著減少，26-27%的VGCC抗體陽性的患者在N-和P/Q-型檢測呈雙陽性。

這項研究同樣具有局限性。它是具有一定代表性的，并受到LEMS患者樣本可用性和僅有一部分患者的臨床數(shù)據(jù)可用性的限制。LEMS的罕見對驗證N-VGCC抗體的檢測方法提出了挑戰(zhàn)。因此，本研究沒有確定N型VGCC對LEMS的檢測性能。然而，這項研究中觀察到的特異性反映了LEMS的估計患病率。根據(jù)現(xiàn)有的臨床數(shù)據(jù)，兩個實驗室之間的差異涉及N-VGCC弱陽性結(jié)果，這些結(jié)果與其他免疫狀況有關(guān)，主要為自身免疫，而不是LEMS或相關(guān)疾病。

值得注意的是，關(guān)于弱陽性N-VGCC抗體結(jié)果的特異性問題以前也曾報道過，在使用較大的抗體譜樣本組進行檢測時可觀察到假陽性結(jié)果的頻率更高。與弱陽性結(jié)果的特異性相關(guān)的問題表明，建立臨界點是一個挑戰(zhàn)，即使是對最初開發(fā)該測試的實驗室也是如此。盡管N-VGCC抗體缺乏疾病特異性，但假陽性不一定是純粹的檢測問題。因此在臨床實踐中使用基于經(jīng)驗的陽性預(yù)測值。對于弱陽性結(jié)果，不同檢測方法之間的一致性較差的情況并不少見。就評估自身抗體檢測而言，這可能是由于檢測設(shè)計(抗原、樣本稀釋、孵育時間等)、原理和/或缺乏標準化所致。因此，一種檢測法的結(jié)果不一定能與另一種檢測法的結(jié)果互通(圖1D)。此外，對于N-VGCC抗體等分析物的弱陽性結(jié)果的解釋受限于其低患病率、疾病譜不完整以及一些抗體出現(xiàn)在疾病的臨床前階段，這些現(xiàn)象可能會混淆對性能的評估。雖然這項研究不是為解決這些問題而設(shè)計的，但我們的數(shù)據(jù)顯示了兩種N-VGCC檢測之間的差異，在沒有完整的患者臨床病史的情況下，這限制了對所描述結(jié)果的解釋。在常規(guī)檢測中，這些差異的實際影響及其對患者護理的影響仍將是未知的。

魯婧怡 譯，RSR TJ 校對